Objectif - Introduction
Le genre Enterobacter décrit en 1960, contient maintenant 20 espèces. L’évolution de la taxonomie de ce genre avec la description de nouvelles espèces rend l’identification difficile par les méthodes phénotypiques mais meilleure avec la spectrométrie de masse Vitek®MS. Le développement de cette méthode nécessite en référence des souches bien caractérisées dans notre collection interne. Le séquençage 16S n’étant pas assez discriminant, c’est le gène gyrB qui a été analysé en phylogénie pour confirmer les souches ou les reclasser en nouvelles espèces d’Enterobacter ou en genres apparentés (Klebsiella, Lelliottia).

Matériels (ou Patients) et méthodes
475 souches de différentes espèces d’Enterobacter, incluant celles du complexe Enterobacter cloacae et issues de la collection bioMerieux, ont été séquencées sur une région polymorphique de 520 pb du gène gyrB. L’analyse des séquences par BLAST contre la base publique NCBI/GenBank, puis l’analyse phylogénétique permettent de classer les séquences en clusters bien différenciés par espèce.
 

Résultats
Pour toutes espèces confondues, 33.7% des souches ont été confirmées dans l’espèce/sous-espèce attendue.
59.40% sont à reclasser dans les espèces issues de Enterobacter cloacae : E.cloacae ssp cloacae, E.cloacae ssp dissolvens, E.hormaechei ssp hormaechei, E.hormaechei ssp oharae, E.hormaechei ssp steigerwaltii, E.xiangfangensis.
6.90% sont à reclasser dans d’autres espèces E.asburiae, E.kobei, E.ludwigii, Lelliottia (Enterobacter) amnigena.et dans la nouvelle espèce E.bugandensis.
Les espèces E.massiliensis et E.soli sont bien classées mais leurs clusters sont encore à confirmer.

Conclusion
Le gène gyrB permet une bonne discrimination des espèces d’Enterobacter et des genres apparentés incluant les espèces qui n’étaient pas discriminées par les techniques phénotypiques.
La biologie moléculaire n’est pas utilisée en routine dans les laboratoires, mais elle permet le suivi de la collection de souches selon les évolutions taxonomiques et ainsi permettre de sélectionner des souches bien caractérisées pour le développement d’une base de connaissance Vitek®MS plus fiable.
 

Mots Clés
Enterobacter, gyrB, caractérisation

Objectif - Introduction
The genus Enterobacter is recognized as an important opportunistic pathogen notably in nosocomial infections. The taxonomy of Enterobacter genus is complex. It is composed of two main species: Enterobacter aerogenes and Enterobacter cloacae complex (ECC). In Enterobacter genus, carbapenem resistance is mainly mediated by deregulation of intrinsic cephalosporinase associated with decrease of memebrane permeability. In a lesser extent, this resistance may also be due to the production of carbapenemase notably OXA-48-like. We described here the genomic characterization of first isolates of VIM-2-producing Enterobacter hormachei subsp. Steigerwaltii. 

Matériels (ou Patients) et méthodes
Three isolates of VIM-2 producing were fully sequenced using illumina's technology. SNPs analysis was performed  to compare these isolates. Genetic context of bla_VIM-2 gene was determined.
Antimicrobial susceptibilities were determined by the disc diffusion method on Mueller-Hinton agar, and were interpreted according to CLSI guidelines. Plasmid extraction and transfer were performed.

Résultats
The three Enterobacter spp. isolates were identified using Maldi-TOF as Enterobacter cloacae complex. Phylogeny based on hsp60 and rpoB sequencing revealed that these isolate actually belong to E. hormaechei subspecies steigerwaltii. Analysis of the resistome revealed, in addition to the bla_VIM-2 gene, the presence of several β-lactamases including the narrow-spectrum β-lactamase bla_TEM-1a, bla_OXA-9 and the natural cephalosporinase bla_ACT-like gene. Resistome also included aminoglycoside resistance genes aac(6’)-Ib and aadA1. The aac(6’)-Ib gene does not possess the two substitutions W104R and D181Y as well as the substitution S83Y in the QRDR of GyrA. The analysis of the genetic context of the bla_VIM-2 revealed that its acquisition was mediated by a class II Tn2-derivative transposon related to Tn1332. This transposon was identified only in Pseudomonas genus. SNPs analysis revealed that these 3 isolates were related but one isolate was more distant in which the transposon was not inserted in the same gene.

Conclusion
We report here for the first time VIM-2-producing Enterobacter hormachei subsp. Steigerwaltii in France. The acquisition of bla_VIM-2 was due to the insertion of a peculiar transposon identified only once in Pseudomonas putida.

Mots Clés
carbapénèmase
VIM-2
intégron
transposon

Objectif - Introduction
En Septembre 2016, 2 souches (Eh22 et Eh23) multirésistantes aux antibiotiques (AB) d’Enterobacter cloacae complex (ECC) ont été isolées des urines de 2 patients collectées par un laboratoire privé de Djerba (Tunisie). Le but de l’étude a été d’analyser les relations épidémiologiques entre les 2 souches et de caractériser leurs gènes de résistance ainsi que leur support génétique.
 

Matériels (ou Patients) et méthodes
Les résistances aux AB ont été transférées par conjugaison à Escherichia coli C600 (azide-R). La détermination de la résistance aux AB d’Eh22 et Eh23, et des transconjugants (Tc22 et Tc23) a été déterminée par la méthode de diffusion en milieu MH, utilisant 32 disques (http://www.sfm.microbiologie.org). L’identification d’Eh22 et Eh23 a été confirmée par le séquençage du gène hsp60. Le typage par MultiLocus Sequence Typing a été effectué selon les données du site MLST WEBserver (http://pubmlst.org/ecloacae/). Le pulsotypage a été réalisé en utilisant Spe1, après séparation des patterns par PFGE. Le contenu plasmidique a tout d’abord été visualisé après linéarisation par la nucléase S1, suivi d’une PFGE. Puis le plasmide de 300 kb a été séquencé par la méthode illumina (plate-forme génomique, Université Bordeaux).
 

Résultats
Les 2 isolats, de pulsotypes identiques, appartenaient à la séquence type ST177 d’Enterobacter hormaechei (ECC VIII). Ils restaient seulement sensibles à la fosfomycine, aux carbapénèmes et à la colistine. L’analyse par S1-PFGE du contenu plasmidique des transconjugants a montré la présence de 2 plasmides d’environ 300 kb (pTc22) et 100 kb. Le séquençage de pTc22, de groupe d’incompatibilité IncHI2, a permis obtenir 26 contigs dont l’assemblage est en cours d’analyse. Les résultats préliminaires ont révélé de fortes similitudes entre pTc22 avec un plasmide de 444 kb isolé de Salmonella spp. (Genbank N° CP028197), portant de nombreux gènes de résistance. Néanmoins, en plus du gène de la ß-lactamase bla_TEM-1 et celui de la ß-lactamase à spectre élargi (BLSE) bla_SHV-12 , le séquençage de pTc22 a aussi montré la présence du gène de la BLSE bla_CTX-M-3 et celui de la céphalosporinase bla_DHA-1.
 

Conclusion
Ce travail montre la présence d’un plasmide conjugatif portant avec des nombreux gènes de résistance chez une souche d’ECC isolée de patients de la communauté, soulignant l’importance de continuer les efforts de surveillance.

Mots Clés
Enterobacter hormaechei
plasmide conjugatif IncHI2
β-Lactamases

 

Objectif - Introduction
Fosfomycin is a broad-spectrum cell wall synthesis inhibitor active against a wide range of Gram-negative and Gram-positive bacteria. In Gram negative bacteria, resistance can result from: i) reduced permeability, ii) amino acid mutations in the active site of the MurA target and iii) production of the fosfomycin-inactivating enzyme FosA. In Klebsiella pneumoniae, FosA is chromosomally encoded and intrinsic to the species. The fosA gene is preceded by a divergently oriented gene coding for a LysR-type transcriptional regulator, hereafter FosR. The aim of this study was to characterize the role of FosR in fosA expression and in fosfomycin resistance in K. pneumoniae.
 

Matériels (ou Patients) et méthodes
Fosfomycin resistance was determined by the agar dilution method and disk diffusion in presence and absence of the FosA inhibitor sodium phosphonoformate (PPF). The expression of fosA was quantified by RT-qPCR. The lysR-fosA genes were cloned in the low-copy plasmid and then transformed in the fosfomycin-sensitive E. coli TOP10. Site-directed mutagenesis was used to introduce mutations in the lysR gene.
 

Résultats
Among a collection of 20 K. pneumoniae clinical isolates, we identified 3 fosfomycin-resistant strains, whose susceptibility to fosfomycin was restored by addition of PPF. In these three isolates, expression of the fosA gene was 10- to 100-fold higher as compared to a fosfomycin susceptible K. pneumoniae strain as control. Expression of the fosA gene was not inducible by addition of fosfomycin at subinhibitory concentrations. Mutations within the fosR gene of the fosfomycin-resistant strains (fosR-R) were identified. Although cloning of lysR-fosA tandem amplified from a susceptible K. pneumoniae strain (fosR-wt) reduced the fosfomycin susceptibility of E. coli TOP10, introduction of mutations found in the fosR-R genes significantly increased E. coli resistance to fosfomycin. Moreover, fosfomycin resistance of E. coli containing fosR-R mutations could be restored by PPF, supporting an active role of FosA in the increased resistance to fosfomycin. RT-qPCR analysis showed that fosR-R mutations correlated with increased fosA mRNA levels.

Conclusion
Here we characterized FosR, a novel LysR-type transcriptional regulator controlling the expression of fosA in K. pneumoniae, and thus, its resistance to fosfomycin.

Mots Clés
K. pneumoniae, fosfomycin, FosA, LysR-type transcription regulators (LTTRs), resistance

Objectif - Introduction
Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii is growing mostly as a result of expression of diverse carbapenemases. Data from Dubai, a touristic and business emirate that converges multiple nationalities, are limited. The objectives of the current study were to investigate the mechanisms of carbapenem resistance and the genetic relatedness of A. baumannii isolates recovered in Dubai hospitals.

Matériels (ou Patients) et méthodes
From June 2015 to June 2016, carbapenem-resistant A. baumannii were collected from 4 hospitals in Dubai, and subjected to antimicrobial susceptibility testing, to molecular investigation of carbapenemases by PCR-sequencing, and to fingerprinting by ERIC-PCR.

Résultats
A total of 32 carbapenem-resistant A. baumannii were studied. All isolates were resistant to amoxicillin/clavulanate, cefepime, cefotaxime, imipenem, meropenem, ciprofloxacin and levofloxacin. A total of 96.9% of isolates were resistant to gentamycin, trimethoprim-sulfamethoxazole, doxycycline and ceftazidime and five isolates were sensitive to amikacin. Genotyping revealed the production of OXA-23 carbapenemase by 18 isolates (56.25%), GES-11 by 10 (31.25%) and for the first time NDM-1 by 2 (6.25%) isolates. KPC and VIM-1 carbapenemases were not detected. One isolate co-produced the three carbapenemases OXA-23, GES-11 and NDM-1 and seven isolates expressed both OXA-23 and GES-11. ERIC-PCR fingerprinting revealed 8 pulsotypes, each including from 1 to 6 isolates and suggesting that carbapenemase genes may have disseminated via horizontal transfer across various clones.

Conclusion
This study established baseline evidence of OXA-23, GES-11 and for the first time NDM-1 producing A. baumannii in Dubai, indicating the need for further investigation.

Mots Clés
Imipenem-resistant Acinetobacter baumannii
OXA-23
GES-11
ERIC-PCR

Objectif - Introduction
Pseudomonas aeruginosa is a frequent nosocomial pathogen that causes a wide range of opportunistic infections. Infections by P.aeruginosa are diverse and difficult to treat due to its ability to develop resistance under antibiotic pressure and to produce a variety of virulence factors.
The aim of this study was to characterize ß-lactamases responsible for resistance to ceftazidime in CAZ-R P.aerugionsa strains isolated in a Tunisian hospital between 2012-2016, to detect the presence of two virulence factors (ExoS and ExoU) and to determine their serotypes.

Matériels (ou Patients) et méthodes
Clinical isolates of CAZ-R P.aeruginosa obtained from patients at a University Hospital in Sfax-Tunisia between 2012 and 2016 were included. Specific primers were used in PCR based assays to investigate extended-spectrum β-lactamase (ESBL) and carbapenemases genes and the virulence genes exoS and exoU. O-serotyping was determined by slide agglutination test using O-specific antisera.

Résultats
During the study period, 421 non-repetitive strains of CAZ-R P.aeruginosa were isolated. The study focused on 259 strains that were conserved. PCR showed that 29% (75/259) of the isolates harbored blaGES gene and 8.5% (22/259) blaSHV gene, while blaVIM gene was present in 19.3% of isolates (50/259). The genes blaVEB, blaPER, and blaIMP were not detected. PCR sequencing of the amplified fragments obtained from representative isolates revealed 10 blaGES-1, 10 blaSHV-2a, and 10 blaVIM-2.  The serotype O12 (51.7%) and the serotype O 11 (35.8%) were the most frequently identified in the ESBL and metallo-ß-lactamase-producing isolates. Regarding the virulence genes, 49.1% of the strains produced ExoS, 43.2% produced ExoU and 4 strains were positive for both ExoS and ExoU.

Conclusion
The present study is the first to describe the spread of blaGES-1 among P.aeruginosa isolates in Tunisia. A high prevalence of ExoS and ExoU virulence factors, exceeding 40% was reported in our study. A depth study of the epidemiological link between CAZ-R P.aeruginosa isolates will allow the establishment of appropriate means to fight against the spread of such strains.

Mots Clés
Ceftazidime-resistant 
Pseudomonas aeruginosa
extended-spectrum β-lactamase genes
carbapenemases genes 
virulence factors
 

Objectif - Introduction

Les 16S rRNA méthylases (Met) confèrent une résistance de haut niveau à tous les aminoglycosides utilisés pour traiter les infections graves à bacilles à gram négatif et sont associés à la multirésistance aux antibiotiques. Le but de notre étude était d’effectuer la caractérisation génomique d’une collection de souches de E. coli (Ec) productrices de Met.

Matériels (ou Patients) et méthodes

Entre 2008 et 2014, 140 Ec panrésistants aux AGS ont été collectés dans 9 hôpitaux de la région parisienne (Avicenne, Beaujon, Bichat, Henri Mondor, Lariboisière, Louis Mourier, Robert Debré, Saint-Louis et Versailles). Les souches ont été identifiées par MALDI-TOF MS et les CMIs aux AGs (gentamicine, tobramycine et amikacine) ont été mesurées par microdilution en milieu liquide. Les gènes de résistances de Met ont été recherchés par PCR puis le génome complet des Ec producteurs de Met a été séquencé par technique Illumina®.

Résultats

Parmi les 140 Ec collectés, 107 étaient panrésistants à tous les AGs dont 30 à haut niveau (CMI≥256 mg/L). Ces 30 souches étaient toutes productrices de Met. Les gènes identifiés étaient rmtB (n=18), armA (n=11) et rmtC (n=1). La majorité de ces souches produisaient une BLSE de type CTX-M (n=26) et 3 Ec produisaient une carbapénémase (2 NDM et 1 VIM). La plupart de ces souches présentaient des résistances associées aux fluoroquinolones (FQ) (n=21), au cotrimoxazole (n=25) et 6 étaient résistants à la fosfomycine par production du gène fosA.
La présence de CTX-M-3 était associée à armA alors que la résistance aux FQ et fosA étaient associé à rmtB. Au total, 21 ST et 5 phylogroupes différents étaient retrouvés dont les plus fréquents étaient le ST405 (n=4) et le phylogroupe B1 (n=10). Le gène armA était porté par un plasmid IncL/M pour 6/11 Ec Met et associé à la séquence ISCR1. Le support génétique était moins conservé chez les Ec producteurs de rmtB.
L’analyse des SNPs (Single nucleotide polymorphisms) montrait une importante diversité entre les souches, excepté pour trois couples de Ec rmtB positives qui présentaient moins de 100 SNPs de différence.

Conclusion

Notre étude rapporte une grande diversité parmi les Ec producteurs de armA et ceux producteurs de rmtB. L’analyse fine des environnements et supports génétiques permettra de mieux comprendre les mécanismes de diffusion des Met.

Mots Clés

Escherichia coli, méthylase de l’ARNr 16S, plasmide, séquençage haut-débit

Objectif - Introduction
KPC-producing K. pneumoniae is the main carbapenemase in healthcare settings in United State, South America, Greece, Italy and Israel. Since the first identification of KPC-2, more than thirty variants were identified differing by single or double amino acid substitution. Here, we describe the steady-state kinetic characterization of the KPC-28, the first variant without carbapenemase activity. This variant differs from KPC-2 by a substitution H274Y and a deletion of two amino-acid pGlyThr242-243del.

Matériels (ou Patients) et méthodes
The blaKPC-2, blaKPC-3, blaKPC-14 and blaKPC-28 were cloned into pTOPO vector and expressed in E. coli for susceptibility testing or into pET41b for over-expression and purification using nickel-chelate chromatography. The purified proteins were subsequently used for determination of kinetic parameters (Km, kcat) using UV spectrophotometry. Molecular docking calculations were performed to explore the role of this deletion in the carbapenemase activity.

Résultats
Susceptibility testing revealed that KPC-28 exhibited lower MICs for carbapenems and higher for ceftazidime as compared to KPC-2. Kinetic parameters of KPC-28 were compared to those of KPC-14, the closest KPC variant. The catalytic efficiencies of KPC-28 and KPC-14 for carbapenems were 10 fold lower than those obtained for KPC-2 and KPC-3. This peculiar hydrolysis profile was due to the deletion of the 2 AA GT at position 242 and 243 that are in the active site. Furthermore, we observed that the substitution H274Y conferred to KPC-28 higher hydrolytic properties towards ceftazidime.

Conclusion
In this study, we characterize the kinetic parameters of KPC-28, a KPC-2-variant without carbapenemase activity but with increased ceftazidime activity. This variant is worrying as it is detected by molecular and immunochromatographic assays as carbapenemase, even though it is not a carbapenemase anymore. Accordingly, confirmation of carbapenem hydrolysis is mandatory to conclude about carbapenemase production with a KPC positive signal.

Mots Clés
carbapénèmase
KPC
enzymologie
mutant

Objectif - Introduction
Available commercial tools (molecular methods or immunochromatographic assays) usually allow the detection of the five most prevalent carbapenemases (KPC, NDM, VIM, IMP and OXA-48-like) but miss minor carbapenemases. Here, we characterized two enterobacterial isolates with reduced susceptibility to carbapenems and negative for the most commonly encountered carbapenemases genes.

Matériels (ou Patients) et méthodes
Enterobacter hormachei and Citrobacter freundii isolates were recovered from a bile sample and rectal screening respectively. Both isolates were investigated by whole genome sequencing (WGS). Resistance genes were detected by Resfinder database. The blaTMB-1-harboring plasmid was reconstructed using CLC genomic workbench 10.0 and was annotated using the RAST tool. Transfer frequency was determined by conjugation experiments using laboratory strain E. coli J53.

Résultats
These two isolates were resistant to broad-spectrum cephalosporins and carbapenems. Whole genome sequencing revealed the presence of blaTMB-1 gene, which was described only in non-fermenters so far. It was located within an ISKpn19-based composite class 1 transposon. Comparative genomics revealed that this structure was carried on a conjugative IncN-type plasmid within an integration hotspot. Conjugation experiments revealed high transfer frequencies of ca. 1.10-3.

Conclusion
To the best of our knowledge, this study corresponds to the first report of TMB-1-producing Enterobacteriaceae. Despite always described as likely chromosomally-located in non-fermenters, the blaTMB-1 gene is now carried by a conjugative plasmid among Enterobacteriaceae, and thus raises concern about the possible dissemination of this carbapenemase. The blaTMB-1 should be now suspected when PCRs targeting main carbapenemases remained negative.

Mots Clés
carbapénèmase
metallo-beta-lactamase
intégron

Objectif - Introduction
La résistance aux antibiotiques est une problématique majeure pour laquelle une approche « One Health » est désormais indispensable. L’arsenal génétique des bactéries pour s’échanger des gènes (plasmides et îlots génomiques transférables) est un des éléments responsables de la diffusion de la résistance au sein/entre les différents écosystèmes. Les Morganellaceae sont des bactéries ubiquistes, pathogènes opportunistes pour lesquelles les infections dues à des souches multirésistantes ne cessent de s’accroître. L’épidémiologie et les mécanismes moléculaires de la résistance de cette famille sont à ce jour peu explorée.

Matériels (ou Patients) et méthodes
Une collection de 83 souches de Morganellaceae constituée majoritairement de Proteus mirabilis et Morganella morganii résistantes aux céphalosporines de dernières générations, a été rassemblée avec des isolats d’origine humaine (France, Bulgarie et Taiwan), et animale (France). L’étude du résistome et du mobilome associé a été réalisée en combinant des approches phénotypiques et génotypiques (séquençage haut-débit).
 

Résultats
Toutes les souches étaient multirésistantes (> 3 familles d’antibiotiques). Une analyse phylogénétique a révélé une importante diversité à l’exception de quelques clusters proches. Les b-Lactamases à Spectre Etendu du groupe CTX-M ont été majoritairement identifiées (41/83), ainsi que la céphalosporinase acquise CMY-2 (23/83). Les éléments intégratifs et conjugatifs (ICE/IME) des familles SXT (8/83) et SGI1 (13/83) véhiculant respectivement les gènes blaCMY-2 et blaVEB-6 ont été identifiés, certaines souches possédant un ICE et un IME. Un transfert conjugatif de la résistance aux céphalosporines de dernières générations n’a été observé que pour un tiers des souches. Des analyses bioinformatiques approfondies sont en cours afin de confirmer ces premiers résultats et localiser les gènes de résistance.

Conclusion
Contrairement aux principales espèces d'Entérobactéries, les gènes de résistance BLSE/AmpC ne semblent pas principalement localisés sur des plasmides conjugatifs chez les Morganellaceae. Les plasmides conjugatifs IncA/C ainsi que les éléments intégratifs et conjugatifs appartenant aux familles SXT et SGI1 jouent un rôle important dans leur diffusion parmi les espèces de Morganellaceae.

Mots Clés
Proteus mirabilis, Morganella morganii, élément intégratif et conjugatif, SXT, SGI1, plasmides IncA/C, blaCMY-2, blaVEB-6